Die vorliegende Erfindung betrifft biotechnologische Herstellungsverfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung verbesserte Kulturmedien für die Verwendung in biotechnologischen Herstellungsverfahren, Verfahren, die solche verbesserten Medien verwenden, und aus den Verfahren unter Verwendung der verbesserten Kulturmedien erhaltene Produkte.

Biotechnologische Verfahren sind weitverbreitet für die Herstellung von biologischen Produkten. Diese Verfahren beinhalten typischerweise die Kultivierung von Zellen in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die für das Wachstum und die Produktbildung durch die kultivierten Zellen zulässig sind. Zellen, die in der biotechnologischen Produktion nützlich sind, sind Bakterienzellen, Pilzzellen, Hefezellen und Zellen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs.

Tierzellkultur ist lange Zeit für die Herstellung von biologischen Produkten verwendet worden, wie von therapeutischen Proteinen, Polypeptiden, Oligopeptiden oder anderen biologischen Molekülen, wie therapeutischen Polysacchariden. In solchen Zellkulturprozessen werden Tierzellen, die normalerweise genetisch zur Herstellung eines gewünschten Produkts modifiziert wurden, in einem flüssigen, festen oder halbfesten Kulturmedium für Zellproliferation und Produktbildung kultiviert. Ein signifikanter Vorteil von Zellkultur ist die Tatsache, dass Tierzellen und Pflanzenzellen in der Lage sind, post-translationale Modifikationen des Primärprodukts zu leisten, wie Falten und post-translationale Modifikation eines Polypeptids.

In biotechnologischen Herstellungsverfahren, insbesondere in Tierzellkulturen, ist die Kontrolle und Optimierung der Zellkulturbedingungen für die Zellproliferation und Produktbildung kritisch. Ein entscheidender Faktor ist die Mediumzusammensetzung. Die Konzentration und Qualität des Zellkulturendprodukts hängt stark von der Mediumzusammensetzung ab. Tier- und Pflanzenzellkulturen sind besonders anspruchsvoll in Bezug auf die erforderliche Nährstoffzusammensetzung und die Kulturbedingungen. Die erforderlichen Nährstoffe schließen nicht nur Basisquellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Energie, wie Zucker und Ammoniak, ein, sondern es können auch komplexere Nährstoffe, wie essentielle Aminosäuren und Vitamine, erforderlich sein. Aus diesem Grund ist die Ergänzung von Tierzellkulturmedien mit komplexen Nährstoffzusammensetzungen, wie Serum, angewandt worden, um die Tierzellen mit einer breiten Vielfalt an Nährstoffen zu versehen. Allerdings haben regulatorische und Sicherheitsbedenken, sowie Probleme mit der Heterogenität der verfügbaren Quellen von Seren dazu geführt, dass die Industrie die Eliminierung von Serum und anderen nicht definierten Medien aus industriellen Zellkulturprozessen anstrebt. Zellkulturen, die in Serum-freien Medien wachsen gelassen werden, zeigen aber oft Ernährungsmängel. Aus diesem Grund ist viel Aufwand dafür betrieben worden, um diejenigen Nährstoffkomponenten von komplexen Medien sowie ihre optimalen Konzentrationen zu ermitteln, die für ein befriedigendes Wachstum und Proteinbildung in Zellkulturen erforderlich sind. Die Versorgung von Zellkulturen mit Aminosäuren hat bekanntermaßen eine erhebliche Auswirkung auf die Wachstumsrate und Produktion. Glutamin wird routinemäßig in Zellkulturmedien verwendet, da es eine wichtige Quelle von Kohlenstoff, Stickstoff und Energie für die kultivierten Zellen ist. Es wurde gezeigt, dass die Menge an Glutamin, die für das optimale Wachstum von Tierzellkulturen notwendig ist, 3- bis 10-fach höher ist als die Menge von anderen Aminosäuren (Eagle et al., Science 130:432-37). Allerdings ist Glutamin als Nährstoff instabil, wenn er in Wasser bei erhöhten Temperaturen, wie Hitzesterilisationsbedingungen, gelöst ist, weil Pyroglutamat und Ammoniak unter Hitze gebildet werden (Roth et al. 1988, In Vitro Cellular Developmental Biology 24(7): 696-98). Aus diesem Grund wird Glutamat oft in Zellkulturmedien anstatt Glutamin verwendet (Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-based Therapies, 52, Sadettin et al., Hrsg., Taylor und Francis Group, 2006). Andere Gruppen haben versucht, die Bildung von unerwünschten Substanzen, wie Pyroglutamat und Ammoniak, durch Zugabe von Glutamin-haltigen Dipeptiden, wie Alanyl-Glutamin oder Glycyl-Glutamin, zu dem Zellkulturmedium zu vermeiden (Roth et al. (1988), In Vitro Cellular Developmental Biology 24(7): 696-98). Noch andere Gruppen haben das Acylieren von Dipeptiden vorgeschlagen, um sie unter Hitzesterilisationsbedingungen stabiler zu machen. Die US 5 534 538 A beschreibt N-Acyldipeptide und ihre Verwendung in hitzesterilisierten enteralen oder parenteralen Ernährungsprodukten.

Franek et al. (2002, Biotechnol. Prog. 18, 155-158; US 2004/0072341 A1) haben verschiedene synthetische Oligopeptide (einschließlich Oligo-Gly, Oligo-Ala) auf ihre Wirkung auf eine Mauszelllinie in Serum-freiem Medium gescreent bzw. untersucht. Sie berichteten, dass zwar die einzelne Aminosäure und die getesteten Dipeptide nicht wesentlich die Kulturleistung veränderten, doch Tri-, Tetra- und Penta-Glycin, sowie Tri- und Tetra-Alanin die Dichte von lebensfähigen Zellen und die Zellviabilität verbesserten.

Die WO 2011/133902 A2 offenbart Zellkulturmedien, die Dipeptide umfassen, wobei die Dipeptide Aminosäuren mit einer geringen Löslichkeit in Wasser, in diesem Fall Tyrosin und Cystein, einschließen. Cystein besitzt nicht nur eine geringe Löslichkeit in Wasser, sondern ist auch instabil aufgrund des Vorhandenseins einer reaktiven Thiolgruppe(n). Die Autoren fanden heraus, dass durch Einbringung von Tyrosin und Cystein in Dipeptiden Löslichkeits- und Stabilitätsprobleme der Aminosäuren verbessert werden können. Die Autoren stellten auch eine verbesserte Haltbarkeit der resultierenden Zellkulturmedien fest. In einer Ausführungsform ist die verbleibende Aminosäure des Dipeptids (nicht Cystein oder Tyrosin) Asparagin.

Die WO 2012/019160 A1 offenbart Tierzellkulturen, in denen während der Produktionsphase das Serum-freie Medium mit Tyr- und His-haltigen Dipeptiden ergänzt wird. Positive Wirkungen der Zugabe der Tyr- und His-haltigen Dipeptide auf das Wachstum und die Produktbildung werden beschrieben.

Die EP 0220379 A1 und DE 3538310 A1 offenbaren die Verwendung von Glutamin-haltigen Dipeptiden und Tripeptiden in Zellkulturmedien. Glutamin wird in Form von Dipeptiden hinzugefügt, um Probleme zu vermeiden, die von der Instabilität von Glutamin unter erhöhten Temperaturen stammen. Die Glutamin-haltigen Dipeptide werden als eine temperaturunempfindliche Glutaminquelle verwendet.

Die JP 61271985 A offenbart ein Kulturmedium, das für Tierzellen nützlich ist, die die Dipeptide Xxx-L-Glutamin einschließen, worin Xxx Glycin, D/L-Alanin, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Valin, L-Leucin, L-Serin, L-Lysin oder L-Phenylalanin ist.

Während Zellkulturmedien, die im oben genannten Stand der Technik beschrieben werden, eine zufriedenstellende Leistung und Eigenschaften für bestimmte Zellkulturverfahren bereitstellen, sind Kulturmedien des Stands der Technik immer noch nicht optimal. Es besteht Bedarf an weiteren verbesserten Kulturmedien, die besseres Wachstum und Produktbildung in biotechnologischen Produktionsverfahren fördern.

Die oben genannten Defizite von bekannten Kulturmedien werden von der vorliegenden Erfindung angegangen. Die Erfindung ist durch die Begriffe der anhängigen unabhängigen Ansprüche definiert. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind durch die abhängigen Ansprüche definiert.

Die Erfindung betrifft daher ein Kulturmedium, vorzugsweise ein Zellkulturmedium, welches ein Oligopeptid von 2 - 10 Aminosäureeinheiten in der Länge umfasst, wobei die Aminosäureeinheiten natürliche Aminosäuren sind und wenigstens eine Aminosäureeinheit eine Asparagineinheit ist, wobei das Oligopeptid folgende Aminosäuren nicht umfasst: Tyrosin, Cystein, Lysin, Leucin, Isoleucin, Glutaminsäure, Glycin.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Kulturmediums der Erfindung zum Kultivieren von Zellen, vorzugsweise Pflanzenzellen, Tierzellen oder Säugerzellen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkulturprodukts, welches die folgenden Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer Zelle, die zur Produktion des Zellkulturprodukts imstande ist; (ii) Kontaktieren der Zelle mit einem Kulturmedium gemäß der Erfindung; und (iii) Gewinnen des Zellkulturprodukts aus dem Kulturmedium oder aus der Zelle.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden ausführlicher in der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben.

Die 1 veranschaulicht die Dichte von lebensfähigen Zellen im Zeitverlauf in verschiedenen Kulturen, die Zellkulturmedien mit variierenden Mengen eines Oligopeptids gemäß der Erfindung verwenden.Die 2 veranschaulicht die Zellenlebensfähigkeit im Zeitverlauf in verschiedenen Zellkulturen, die Zellkulturmedien mit variierenden Mengen eines Oligopeptids gemäß der Erfindung verwenden.Die 3 veranschaulicht relative Produktkonzentrationen, die von Zellkulturen erhalten werden, die Zellkulturmedien mit variierenden Mengen eines Oligopeptids gemäß der Erfindung verwenden.

Ein „Kulturmedium“ gemäß der Erfindung ist als ein flüssiges oder festes Medium zu verstehen, das Nährstoffe enthält, wobei das Medium zum Ernähren und Unterstützen bzw. Erhalten von Leben und/oder zur Produktbildung von Zellen in der Kultur geeignet ist. Die kultivierten Zellen gemäß der Erfindung können Bakterienzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Tierzellen, wie Säugerzellen oder Insektenzellen, und/oder Pflanzenzellen, z. B. Algen, sein. Typischerweise stellt ein Kulturmedium essentielle und nicht-essentielle Aminosäuren, Vitamine, wenigstens eine Energiequelle, Lipide und Spurenelemente bereit, die alle von der Zelle zur Lebenserhaltung, zum Wachstum und/oder zur Produktbildung erforderlich sind. Das Kulturmedium kann auch Komponenten enthalten, die das Wachstum und/oder Überleben über der Minimalrate steigern, darin eingeschlossen Hormone und Wachstumsfaktoren. Das Kulturmedium hat vorzugsweise einen pH-Wert und eine Salzkonzentration, die Leben, Wachstum und/oder die Produktbildung der Zellen unterstützt. Ein Kulturmedium gemäß der Erfindung umfasst vorzugsweise alle Nährstoffe, die notwendig sind, um Leben und Proliferation der Zellkultur zu erhalten. Bevorzugte Kulturmedien sind definierte Medien.

Ein „definiertes Medium“ gemäß der Erfindung ist ein Medium, das keine Zellextrakte, Zellhydrolysate oder Proteinhydrolysate enthält. Bevorzugte definierte Medien umfassen keine Komponenten von unbekannter Zusammensetzung. Wie üblicherweise von einem Fachmann auf dem Gebiet verstanden, sind definierte Medien in der Regel frei von Komponenten tierischer Herkunft. Vorzugsweise haben alle Komponenten eines definierten Mediums eine bekannte chemische Struktur. Bevorzugte definierte Medien sind Serum-freie Medien. Andere bevorzugte definierte Medien sind synthetische Medien. Andere Kulturmedien als definierte Kulturmedien werden als „komplexe“ Kulturmedien bezeichnet.

Als „Zellkulturmedium“ ist ein Kulturmedium zu verstehen, das für die Lebenserhaltung, Proliferation und/oder Produktbildung von Tierzellen und/oder Pflanzenzellen geeignet ist.

Ein „Nährstoff“ gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine chemische Verbindung oder Substanz, die von Zellen zum Leben und Wachsen benötigt wird. Der Nährstoff wird vorzugsweise von der Zelle aus der Umgebung aufgenommen. Nährstoffe können „organische Nährstoffe“ und „anorganische Nährstoffe“ sein. Organische Nährstoffe schließen Kohlenhydrate, Fette, Proteine (oder ihre Bausteine, z. B. Aminosäuren) und Vitamine ein. Anorganische Nährstoffe sind anorganische Verbindungen wie, z. B. diätetische Mineralien und Spurenelemente. „Essentielle Nährstoffe“ sind Nährstoffe, die die Zelle nicht selbst synthetisieren kann und die daher für die Zelle durch das Kulturmedium bereitgestellt werden müssen.

Ein „Zellkulturprodukt“ gemäß der Erfindung ist als jede nützliche biologische Verbindung zu verstehen, die durch Zellen in Zellkultur produziert wird. Bevorzugte Zellkulturprodukte der Erfindung sind therapeutische Proteine, diagnostische Proteine, therapeutische Polysaccharide, wie Heparin, Antikörper, z. B. monoklonale Antikörper, Wachstumsfaktoren, Interleukin, Peptidhormone und Enzyme.

Eine „Aminosäure“ im Kontext der vorliegenden Erfindung ist als ein Molekül zu verstehen, welches eine Amino-funktionelle Gruppe (-NH2) und eine Carbonsäure-funktionelle Gruppe (-COOH) zusammen mit einer Seitenkette, die für die betreffende Aminosäure spezifisch ist, umfasst. Bevorzugte Aminosäuren der Erfindung sind Alpha-Aminosäuren, insbesondere die 20 „natürlichen Amino“-Säuren wie folgt:Alanin(Ala / A)Arginin(Arg / R)Asparagin(Asn / N)Asparaginsäure(Asp / D)Cystein(Cys / C)Glutaminsäure(Glu / E)Glutamin(Gln / Q)Glycin(Gly / G)Histidin(His / H)Isoleucin(Ile / I)Leucin(Leu / L)Lysin(Lys / K)Methionin(Met / M)Phenylalanin(Phe / F)Prolin(Pro / P)Serin(Ser / S)Threonin(Thr / T)Tryptophan(Trp / W)Tyrosin(Tyr / Y)Valin(Val/V)

Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck „natürliche Aminosäuren“ so zu verstehen, dass er sowohl die L-Form als auch die D-Form der oben aufgelisteten 20 Aminosäuren einschließt. Die L-Form ist jedoch bevorzugt. In einer Ausführungsform schließt der Begriff „Aminosäure“ auch Analoga oder Derivate von diesen Aminosäuren ein.

Eine „freie Aminosäure“ gemäß der Erfindung ist als eine Aminosäure zu verstehen, deren Amino- und (alpha-) carbonsäurefunktionelle Gruppe in freier Form vorliegt, d. h. die nicht an andere Moleküle gebunden ist, z. B. eine Aminosäure, die keine Peptidbindung bildet. Freie Aminosäuren können auch als Salze oder in Hydratform vorliegen. Bei Bezugnahme auf eine Aminosäure als Teil eines oder in einem Oligopeptid ist dies als Bezug auf diesen Teil der betreffenden Oligopeptidstruktur, die von der betreffenden Aminosäure abgeleitet ist, zu verstehen gemäß den bekannten Mechanismen der Biochemie und Peptid-Biosynthese.

Ein „Wachstumsfaktor“ gemäß der Erfindung ist als eine beliebige natürlich vorkommende Substanz zu verstehen, die zum Stimulieren des Zellwachstums, der Proliferation und Zelldifferenzierung fähig ist. Bevorzugte Wachstumsfaktoren liegen in der Form eines Protein- oder Steroidhormons vor. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist der Ausdruck „Wachstumsfaktor“ als Bezug auf einen Wachstumsfaktor zu interpretieren, der aus der Auflistung gewählt ist, die aus Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), inklusive saurem FGF und basischem FGF, Insulin, Insulin-artigem Wachstumsfaktor (IGF), epithelialem Wachstumsfaktor (EGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), (Blut-)Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) und transformierendem Wachstumsfaktor (TGF), inklusive TGFalpha und TGFbeta, Cytokin, wie Interleukine 1, 2, 6, Granulozyten-stimulierendem Faktor und Leukozyt-inhibitorischem Faktor (LIF) besteht.

Ein „Oligopeptid“ gemäß der Erfindung ist als eine Peptidverbindung zu verstehen, die aus 2 bis 20 Aminosäuren besteht. Stärker bevorzugte Oligopeptide der Erfindungen sind Oligopeptide, die aus 2 - 10 Aminosäuren, 2 - 6 Aminosäuren, 2 - 5 Aminosäuren, 2 - 4 Aminosäuren oder 2 - 3 Aminosäuren bestehen. Die am meisten bevorzugten Oligopeptide gemäß der Erfindung sind Dipeptide.

Ein „Peptid“ ist als ein Molekül zu verstehen, das wenigstens zwei Aminosäuren umfasst, die durch eine Peptidbindung kovalent miteinander gekoppelt sind (R1-CO-NH-R2).

Der Ausdruck „Xxx“, wenn er hierin in Verbindung mit einer Aminosäure verwendet wird, ist als Bezug auf jede natürliche Aminosäure, wie hierin weiter oben aufgelistet, zu verstehen.

Der Ausdruck „N-acyliert“ mit Bezug auf eine chemische Verbindung, wie eine Aminosäure, ist in der Bedeutung zu verstehen, dass die N-acylierte Verbindung durch die Hinzufügung einer Acylgruppe zu einer Stickstoff-funktionellen Gruppe der Verbindung modifiziert ist. Vorzugsweise ist die Acylgruppe zu der Alpha-Aminogruppe der Aminosäure hinzugefügt.

Eine „sterile Form“ einer Nährstoffzusammensetzung, eines Kulturmediums, eines Zellkulturmediums oder dergleichen ist als die Definition des Fehlens irgendeines lebenden Stoffs in der Zusammensetzung zu verstehen.

Ein „festes Kulturmedium“ im Kontext der vorliegenden Erfindung ist als irgendein nicht-flüssiges oder nicht-gasförmiges Kulturmedium zu verstehen. Bevorzugte feste Kulturmedien der Erfindung sind gelartige Kulturmedien, wie Agar-Agar, Carrageen oder Gelatine.

„Passagieren von Zellen“ (auch bekannt als Subkultur oder Splitting bzw. Aufsplitten von Zellen) im Kontext der vorliegenden Erfindung ist in der Bedeutung einer Übertragung einer kleinen Zahl von Zellen in einen neuen Kulturbehälter zu verstehen. Zellen können über einen längeren Zeitraum kultiviert werden, wenn sie regelmäßig aufgesplittet werden, da dies die mit einer verlängerten hohen Zelldichte assoziierte Seneszenz vermeidet. Suspensionskulturen werden leicht mit einer kleinen Menge von Kultur, die einige Zellen enthält, in einem größeren Volumen von frischen Medien verdünnt.

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Kulturmedium, vorzugsweise ein Zellkulturmedium, wobei das Kulturmedium wenigstens ein Oligopeptid mit 2 - 10 Aminosäuren in der Länge umfasst, wobei die Aminosäuren natürliche Aminosäuren sind und wenigstens eine Aminosäureeinheit Asparagin (Asn) ist, wobei das Oligopeptid folgende Aminosäuren nicht umfasst: Tyrosin (Tyr), Cystein (Cys), Lysin (Lys), Leucin (Leu), Isoleucin (lle), Glutaminsäure (Glu), Glycin (Gly).

In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Oligopeptid 2 - 6 Aminosäuren, 2 - 5 Aminosäuren, 2 - 4 Aminosäuren oder 2 - 3 Aminosäuren in der Länge. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Oligopeptid Dipeptid.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung fanden heraus, dass Kulturmedien dieser Art überlegene Eigenschaften gegenüber Zellkulturmedien des Stands der Technik besitzen. Es wurde durch die Erfindung der vorliegenden Anmeldung herausgefunden, dass die erfindungsgemäßen Kulturmedien in der Lage sind, die Dichte von lebensfähigen Zellen und die Zellüberlebensfähigkeit einer Zellkultur bezüglich eines Zellkulturmedium zu erhöhen, welches die gleiche Menge der relevanten Aminosäuren umfasst, jedoch in Form von freien Aminosäuren. Trotz der Tatsache, dass die gleiche Menge von Aminosäuren in dem herkömmlichen Zellkulturmedium vorhanden ist, wird die Zelllebensfähigkeit und die Zellzahl erhöht, wenn freie Aminosäuren durch die Asn-haltigen Oligopeptide der Erfindung ersetzt werden.

In einer Ausführungsform ist das Oligopeptid Asn-Xxx oder Xxx-Asn, wobei Xxx eine beliebige natürliche Aminosäure, wie vorstehend definiert, ist. Xxx ist vorzugsweise eine natürliche Aminosäure, die nicht Tyr, Cys oder Lys ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Oligopeptid Xxx-Asn, wobei Xxx wie vorstehend definiert ist.

Gemäß einer anderen Ausführungsform kann das Oligopeptid ferner eine Aminosäure umfassen, die aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Alanin, Serin, Valin, Prolin, Asparaginsäure, Glutamin und Glutaminsäure.

In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Oligopeptid Glutamin (Gln). Somit ist ein bevorzugtes Oligopeptid der Erfindung Gln-Asn (L-Glutaminyl-L-asparagin) ist. Ein besonders bevorzugtes Oligopeptid der Erfindung ist Asn-Gln (L-Asparaginyl-L-glutamin).

In bevorzugten Ausführungsformen ist das Oligopeptid nicht N-acyliert. N-Acylierung, so ist bekannt, verbessert die Wärmestabilität von bestimmten Oligopeptiden. Jedoch fand man heraus, dass N-acylierte Oligopeptide auch zu einer unterlegenen Dichte von lebensfähigen Zellen und Lebensfähigkeit führen können.

In einer Ausführungsform umfasst das Kulturmedium ferner wenigstens ein Kohlenhydrat, wenigstens eine freie Aminosäure, wenigstens ein anorganisches Salz, eine Puffersubstanz und/oder wenigstens ein Vitamin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kulturmedium jeweils wenigstens ein Kohlenhydrat, wenigstens eine freie Aminosäure, wenigstens ein anorganisches Salz, eine Puffersubstanz und wenigstens ein Vitamin.

In einer Ausführungsform der Erfindung enthält das Kulturmedium keinen Wachstumsfaktor. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform kann das Oligopeptid der Erfindung an Stelle eines Wachstumsfaktors zum Fördern des Wachstums und/oder der Proliferation der Zellen in Kultur verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält das Kulturmedium keinerlei Lipide.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt das Kulturmedium in flüssiger Form, in Form eines Gels, eines Pulvers, eines Granulats, eines Pellets oder in Form einer Tablette vor.

In bevorzugten Ausführungsformen ist das Kulturmedium der Erfindung ein definiertes Medium oder ein Serum-freies Medium. Zum Beispiel können Oligopeptide der Erfindung als Ergänzung zu dem CHOMACS CD-Medium von Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Deutschland), zu dem PowerCHO-2 CD-Medium, verfügbar von LONZA (Basel, Schweiz), dem Acti-CHO P-Medium von PAA (PAA Laboratories, Pasching, Österreich), dem Ex-Cell CD CHO-Medium, verfügbar von SAFC, dem SFM4CHO-Medium und dem CDM4CHO-Medium von ThermoFisher (Waltham, USA) supplementiert werden. Die Oligopeptide der Erfindung können auch zum DMEM-Medium (Life Technologies Corp., Carlsbad, USA) supplementiert werden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Ergänzung der oben genannten Medien beschränkt.

In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Kulturmedium ein flüssiges Medium in 2-fach, 3-fach, 3,33-fach, 4-fach, 5-fach oder 10-fach konzentrierter Form (Volumen/Volumen) im Vergleich zu der Konzentration des Mediums bei der Verwendung. Dies erlaubt die Herstellung eines „gebrauchsfertigen“ Kulturmediums durch simples Verdünnen des konzentrierten Mediums mit dem jeweiligen Volumen an sterilem Wasser. Solche konzentrierten Formen des Mediums der Erfindung können auch durch Zugeben desselben zu einer Kultur, z. B. in einem Fed-Batch-Kultivierungsprozess, verwendet werden.

Kulturmedien der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise alle Nährstoffe, die für ein dauerhaftes Wachstum und die Produkterzeugung erforderlich sind. Rezepte für die Herstellung von Kulturmedien, insbesondere Zellkulturmedien, sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe z. B. Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Öztürk und Wei-Shou Hu Hrsg., Taylor und Francis Group 2006). Verschiedene Kulturmedien sind von diversen Quellen im Handel erhältlich.

Die Kulturmedien der Erfindung schließen vorzugsweise eine Kohlenhydratquelle ein. Das Hauptkohlenhydrat, das in Zellkulturmedien verwendet wird, ist Glukose, die routinemäßig bei 5 bis 25 nM zugesetzt wird. Darüber hinaus kann jedwede Hexose, wie Galactose, Fructose oder Mannose, oder eine Kombination verwendet werden.

Das Kulturmedium schließt typischerweise auch wenigstens die essentiellen Aminosäuren (d. h. His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Try, Val) sowie bestimmte nicht-essentielle Aminosäuren ein. Eine nicht-essentielle Aminosäure wird dem Zellkulturmedium typischerweise zugesetzt, wenn die Zelllinie nicht in der Lage ist, die Aminosäure zu synthetisieren, oder wenn die Zelllinie keine ausreichenden Mengen der Aminosäure produzieren kann, um ein maximales Wachstum zu unterstützen. Zusätzlich können Säugerzellen auch Glutamin als eine Hauptenergiequelle verwenden. Glutamin wird oft in höheren Konzentrationen eingesetzt als andere Aminosäuren (2-8 mM). Wie oben erwähnt, kann Glutamin jedoch spontan unter Bildung von Ammoniak zerfallen, wobei bestimmte Zelllinien schneller Ammoniak erzeugen, was toxisch ist.

Die Kulturmedien der Erfindung umfassen vorzugsweise Salze. Salze werden dem Zellkulturmedium zugesetzt, um isotonische Bedingungen aufrechtzuerhalten und osmotische Ungleichgewichte zu verhindern. Die Osmolalität eines Kulturmediums der Erfindung beträgt etwa 300 mOsm/kg, obwohl viele Zelllinien eine etwa 10-prozentige Abweichung dieses Wertes oder höher tolerieren können. Die Osmolalität einiger Insektenzellkulturen ist tendenziell höher als 300 mOsm/kg, und kann 0,5 Prozent, 1 Prozent, 2 bis 5 Prozent, 5- 10 Prozent, 10-15 Prozent, 15- 20 Prozent, 20-25 Prozent, 25-30 Prozent höher als 300 mOsm/kg sein. Die am gängigsten verwendeten Salze im Zellkulturmedium umfassen Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO42-, PO43- und HCO3-(z. B. CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4).

Andere anorganische Elemente können im Kulturmedium vorhanden sein. Sie umfassen Mn, Cu, Zn, Mo, Va, Se, Fe, Ca, Mg, Si und Ni. Viele dieser Elemente sind an enzymatischer Aktivität beteiligt. Sie können in der Form von Salzen, wie CaCl2, Fe(NCO3)3, MgCl2, MgSO4, MnCl2, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, und Ionen der Spurenelemente, wie Selen, Vanadium und Zink, bereitgestellt werden. Diese anorganischen Salze und Spurenelemente können im Handel, zum Beispiel von Sigma (Saint Louis, Missouri), erhalten werden.

Die Kulturmedien der Erfindung umfassen vorzugsweise Vitamine. Vitamine werden von Zellen typischerweise als Cofaktoren verwendet. Die Vitaminanforderungen jeder Zelllinie variieren beträchtlich, obwohl im Allgemeinen zusätzliche Vitamine benötigt werden, wenn das Zellkulturmedium wenig oder gar kein Serum enthält oder wenn die Zellen bei hoher Dichte wachsen gelassen werden. Beispielhafte Vitamine, die vorzugsweise in Kulturmedien der Erfindung vorhanden sind, schließen Biotin, Cholinchlorid, Folsäure, i-Inositol, Nicotinamid, D-Ca++-Pantothenat, Pyridoxal, Riboflavin, Thiamin, Pyridoxin, Niacinamid, Vitamin A, B6, B12, C, D3, E, K und p-Aminobenzoesäure (PABA) ein.

Kulturmedien der Erfindung können auch Serum enthalten. Serum ist der Überstand von geronnenem Blut. Serumkomponenten schließen Anheftungsfaktoren, Mikronährstoffe (z. B. Spurenelemente), Wachstumsfaktoren (z. B. Hormone, Proteasen) und Schutzelemente (z. B. Antitoxine, Antioxidantien, Antiproteasen) ein. Serum ist aus einer Vielzahl von tierischen Quellen, einschließlich Menschen-, Rinder- oder Pferdeserum, erhältlich. Wenn es in Zellkulturmedium gemäß der Erfindung eingesetzt wird, wird Serum typischerweise bei einer Konzentration von 5 - 10% (Vol.) zugegeben. Bevorzugte Zellkulturmedien sind serumfrei.

Um das Zellwachstum in der Abwesenheit von Serum oder in Serum-reduzierten Medien zu fördern, können ein oder mehrere der folgenden Polypeptide einem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium zugesetzt werden: Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), einschließlich saurem FGF und basischem FGF, Insulin, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), epithelialer Wachstumsfaktor (EGF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) und Transformierender Wachstumsfaktor (TGF), einschließlich TGFalpha und TGFbeta, jedes Cytokin, wie Interleukine 1, 2, 6, Granulozyten-stimulierender Faktor, Leukozyteninhibitorischer Faktor (LIF), etc.

Das Kulturmedium der Erfindung kann jedoch auch keinen der oben aufgeführten Wachstumsfaktoren aufweisen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird das Oligopeptid der Erfindung anstelle irgendeines Wachstumsfaktors zur Förderung der Proliferation der Zellen verwendet. Mit anderen Worten macht, gemäß diesem Aspekt der Erfindung, die Anwesenheit des erfindungsgemäßen Oligopeptids die Gegenwart eines Wachstumsfaktors überflüssig. In anderen Ausführungsformen umfasst das Zellkulturmedium keine Polypeptide (d. h. Peptide mit mehr als 20 Aminosäuren).

Zusätzlich können ein oder mehrere Lipide dem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium zugesetzt werden, wie etwa Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Polyensäure und/oder Fettsäuren mit 12, 14, 16, 18, 20 oder 24 Kohlenstoffatomen, wobei jedes Kohlenstoffatom verzweigt oder unverzweigt vorliegen kann, Phospholipide, Lecithin (Phophatidylcholin) und Cholesterol. Ein oder mehrere dieser Lipide können als Zusätze in Serum-freien Medien eingesetzt werden. Phosphatidsäure und Lysophosphatidsäure stimulieren das Wachstum bestimmter verankerungsabhängiger Zellen, wie MDCK, Mausepithel-, und anderen Nierenzelllinien, während Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol das Wachstum menschlicher Fibroblasten in Serum-freien Medien stimulieren. Für Ethanolamin und Cholesterol wurde auch gezeigt, dass sie das Wachstum bestimmter Zelllinien fördern. In manchen Fällen enthält das Zellkulturmedium kein Lipid.

Ein oder mehrere Trägerproteine, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Transferrin, können ebenfalls dem Zellkulturmedium zugesetzt werden. Trägerproteine können beim Transport von bestimmten Nährstoffen oder Spurenelementen helfen. BSA wird typischerweise als Träger von Lipiden, wie Linol- und Ölsäuren, eingesetzt, die in wässriger Lösung unlöslich sind. Darüber hinaus kann BSA auch als ein Träger für gewisse Metalle, wie Fe, Cu und Ni, dienen. In Proteinfreien Formulierungen können nicht-tierische Substitute für BSA, wie Cyclodextrin, als Lipidträger verwendet werden.

Des Weiteren können ein oder mehrere Anheftungsproteine, wie Fibronectin, Laminin und Pronectin, dem Zellkulturmedium zugesetzt werden, um die Anheftung verankerungsabhängiger Zellen an ein Substrat zu unterstützen.

Das Zellkulturmedium kann gegebenenfalls ein oder mehrere Puffersubstanzen enthalten. Geeignete Puffersubstanzen schließen N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N\'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), MOPS, MES, Phosphat, Bicarbonat und andere für die Verwendung in Zellkulturanwendungen geeignete Puffersubstanzen ein. Eine geeignete Puffersubstanz ist eine solche, die Pufferkapazität ohne wesentliche Zytotoxizität für die kultivierten Zellen bereitstellt. Die Auswahl geeigneter Puffersubstanzen liegt im Bereich des gewöhnlichen Fachwissens auf dem Gebiet der Zellkultur.

Polyanionische oder polykationische Verbindungen können dem Kulturmedium hinzugefügt werden, um zu verhindern, dass die Zellen verklumpen, und das Wachstum der Zellen in Suspension zu fördern.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Kulturmedium in flüssiger Form vor. Das Kulturmedium kann aber auch ein festes Medium sein, wie ein gelartiges Medium, z. B. ein Agar-Agar-, Carrageen- oder Gelatine-haltiges Medium.

Vorzugsweise liegt das Kulturmedium in steriler Form vor. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Asn-haltige Oligopeptid in dem Kulturmedium in einer Konzentration von 0,01 bis 20 g/l oder 0,1 bis 10 g/l oder 0,5 bis 5 g/l vorhanden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Asn-haltige Oligopeptid in einer Konzentration von über 0,01, 0,02, 0,04, 0,08, 0,2, 0,4 oder 1 mM vorhanden. Ebenfalls bevorzugt sind Kulturmedien, in denen das Asn-haltige Oligopeptid in einer Konzentration von weniger als 50, 20, 10, 5 oder 2 mM vorhanden ist. Vorzugsweise ist das Asn-haltige Oligopeptid im Medium in einer Konzentration von 0,01 mM bis 40 mM oder 0,1 mM bis 20 mM oder 0,1 mM bis 10 mM oder 0,5 mM bis 10 mM oder 1 mM bis 10 mM oder 1 mM bis 8 mM oder 1 mM bis 6 mM vorhanden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Oligopeptids zwischen 1 mM und 6 mM und das Oligopeptid ist Gln-Asn.

Die obigen Konzentrationen werden als Konzentrationen im nicht-konzentrierten Medium, d. h. die Konzentration, wie sie in der endgültigen Kultur vorhanden sind, angegeben. Konzentrierte Medien können X-fach höhere Konzentrationen aufweisen.

In gewissen Ausführungsformen umfasst das Zellkulturmedium der Erfindung sowohl Asn-haltige Oligopeptide als auch freies Asn. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Asn-haltige Oligopeptid zu einem handelsüblichen Kulturmedium, z. B. zu einem definierten Zellkulturmedium oder zu einem komplexen Zellkulturmedium, hinzugefügt.

Das Kulturmedium der vorliegenden Erfindung kann in konzentrierter Form vorliegen. Es kann z. B. in 2-fach, 3-fach, 3,33-fach, 4-fach, 5-fach, 10-fach, 20-fach, 50-fach oder 100-fach konzentrierter Form (bezogen auf eine Konzentration, die Wachstum und Produktbildung der Zellen unterstützt) vorliegen. Solche konzentrierte Kulturmedien sind zur Herstellung des Kulturmediums zum Gebrauch durch Verdünnen des konzentrierten Kulturmediums mit einem wässrigen Lösungsmittel, wie Wasser, hilfreich. Solche konzentrierte Kulturmedien können in der Batch-Kultur verwendet werden, werden aber vorteilhafterweise auch in Fed-Batch- oder kontinuierlichen Kulturen verwendet, wobei eine konzentrierte Nährstoffzusammensetzung zu einer laufenden Kultivierung von Zellen hinzugesetzt wird, z. B. um Nährstoffe nachzufüllen, die von den Zellen während der Kultur verbraucht worden sind.

In anderen Ausführungsformen der Erfindung liegt das Kulturmedium in trockener Form, z. B. in Form eines trockenen Pulvers oder in Form von Granulaten oder in Form von Pellets oder in Form von Tabletten, vor.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums zur Kultivierung von Zellen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums zur Herstellung eines Zellkulturprodukts.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums zur Kultivierung von Tierzellen oder Pflanzenzellen, besonders bevorzugt von Säugerzellen. In spezifischen Ausführungsformen handelt es sich bei den zu kultivierenden Zellen um CHO-Zellen, COS-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen, HEK-Zellen, HELA-Zellen, AE-1-Zellen, Insektenzellen, Fibroblastenzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Stammzellen, Hautzellen, Endothelzellen und Hybridomazellen. Erfindungsgemäß bevorzugte Zellen der Erfindung sind CHO-Zellen und Hybridomazellen. Erfindungsgemäß am meisten bevorzugt sind CHO-Zellen. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind CHO DG44- und CHO DP12-Zellen.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Zellen mit einem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium umfasst. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren zum Kultivieren von Zellen das Kontaktieren der Zellen mit einem basalen Kulturmedium unter Bedingungen, die die Kultivierung der Zelle unterstützen, und das Ergänzen des basalen Zellkulturmediums mit einem erfindungsgemäßen konzentrierten Medium. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das basale Kulturmedium mit dem konzentrierten Zusatz oder Medium an mehr als einem Tag ergänzt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums, wobei das Kulturmedium wenigstens ein erfindungsgemäßes Oligopeptid umfasst. Das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Kulturmediums umfasst wenigstens einen Schritt des Hinzufügens eines erfindungsgemäßen Oligopeptids zu dem Kulturmedium. Ebenso betrifft ein Aspekt der Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Asn-haltigen Oligopeptids zur Herstellung eines Zellkulturmediums.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modifizieren eines Kulturmediums, wobei das Modifizieren des Kulturmediums die Zugabe von wenigstens einem erfindungsgemäßen Oligopeptid zu besagtem Kulturmedium umfasst.

Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines flüssigen Kulturmediums, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines erfindungsgemäßen festen Mediums, z. B. in Form eines trockenen Pulvers oder in Form von Granulaten oder in Form von Pellets oder in Form von Tabletten; und das Lösen des festen Kulturmediums in einem wässrigen Medium, wie Wasser, umfasst.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für das Kultivieren von Zellen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für Zellkultur.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkulturprodukts, umfassend die Schritte (i) Bereitstellen einer Zelle, die zur Herstellung des Zellkulturprodukts in der Lage ist; (ii) Kontaktieren der Zelle mit einem Kulturmedium der Erfindung; und (iii) Gewinnen des Zellkulturprodukts aus dem Kulturmedium oder aus der Zelle. Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids zur Herstellung eines Zellkulturprodukts.

In bevorzugten Verfahren ist das Zellkulturprodukt ein therapeutisches Protein, ein diagnostisches Protein, ein Polysaccharid, vorzugsweise Heparin, ein Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, ein Wachstumsfaktor, ein Interleukin, ein Virus, ein Virus-artiges Partikel oder ein Enzym.

In einem bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle.

In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid Gln-Asn oder Asn-Gln, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 1 bis 6 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine CHO-Zelle oder eine Hybridomazelle. In einem anderen bevorzugten Verfahren zum Kultivieren von Zellen oder der Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligopeptids für die Kultivierung von Zellen ist das Oligopeptid ein Asn-haltiges Oligopeptid mit 2 - 5 Aminosäuren in der Länge und umfasst nicht Tyr oder Cys, liegt das Oligopeptid in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM vor und ist die Zelle eine Säugerzelle.

Die erfindungsgemäße Kultivierung von Zellen kann in Satz- bzw. Batch-Kultur, in Fed-Batch-Kultur oder in kontinuierlicher Kultur durchgeführt werden.

27,8 g Triethylamin wurden zu 70 g Benzyloxycarbonyl-L-Glutamin (CAS Registrierungs-Nummer 2650-64-8, erhältlich von Peptides International, Inc., USA) in 350 ml Aceton gegeben. Die Lösung wurde auf -10°C gekühlt, und 31,6 g Pivaloylchlorid (Sigma) wurden zugegeben.

Die Mischung wurde 10 min lang gerührt und dann zu einer Lösung von 39,6 g L-Asparagin, 19,0 g Kaliumhydroxid 85% und 41,3 g Kaliumcarbonat in 350 ml Wasser hinzugegeben, auf Raumtemperatur (20 °C) erwärmt und mit 300 ml H2O verdünnt. HCl (konz.) wurde bis zu einem pH-Wert von 2 zugesetzt. Der erhaltene Feststoff wurde filtriert, mit Wasser und Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt 65,2 g Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-asparagin in Form farbloser Kristalle. Der Schmelzpunkt betrug 202 - 204°C.

1H-NMR (DMSO): 1,69 (m, 1H), 1,92 (m, 1H), 2,14 (m, 2H), 2,54 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 4,52 (m, 1H), 5,03 (s, 2H), 6,64 (d, 2H), 7,28 (d, 2H), 7,37 (m, 5H), 7,43 m, 1H), 8,09 (m, 1H).

20,0 g des Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-asparagin wurden dann in 500 ml Wasser suspendiert. 1,0 g Pd/C-Katalysator (5% Pd-Beladung) wurden zugegeben, und es wurde 14 Stunden lang bei 20-30°C und 5 bar hydratisiert. Es wurde bis auf 40-45°C erwärmt, und der Katalysator wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde anschließend unter Vakuum im Rotationsverdampfer aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mit 100 ml EtOH vermischt. Der erhaltene Feststoff wurde filtriert, mit EtOH gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Man erhielt 12,9 g L-Glutaminyl-L-Asparagin in Form farbloser Kristalle. Der Schmelzpunkt betrug 202-204°C.

1H-NMR (DMSO + HCl): 2,05 (m, 2H), 2,42 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 3,94 (m, 1H), 4,62 (m, 1H), 8,46 (s, 3H), 8,96 m, 1H).

Der Effekt des Gln-Asn-Dipeptids auf eine Antikörper-produzierende Chinesische-Hamster-Ovar (CHO)-Zelle (Subclon DG44, Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA) wurde unter Verwendung der Ein-Faktor-auf-Einmal-Analyse (one-factor-at-a-time, OFAT) untersucht.

Die Analyse basiert auf einem Vergleich der lebensfähigen Zelldichte und Zelllebensfähigkeit in einer Reihe von Zellkulturen, der bei im Wesentlichen identischen Kultivierungsbedingungen, jedoch mit steigenden Mengen des Gln-Asn-Dipeptids im Medium durchgeführt wurde. Um die Gesamtmengen an Asn- und Gln-Einheiten (molare Basis) in den verschiedenen Kulturmedien konstant zu halten, wurde die molare Konzentration von freiem Glutamin und freiem Asparagin entsprechend der molaren Menge des zugegebenen Dipeptids verringert. Eine Reihe von Kulturmedien mit zunehmenden Mengen des Gln-Asn-Dipeptids wurde durch Mischen unterschiedlicher Mengen eines Basismediums (umfassend freies Asn und Gln) und eines Testmediums (umfassend Asn-Gln-Dipeptid) hergestellt. Ein im Handel erhältliches definiertes Zellkulturmedium (TC-42, TeutoCell AG, Bielefeld, Deutschland) diente als Basismedium. (Jedes andere geeignete Zellkulturmedium könnte verwendet werden.) Ein Testmedium (TC-42-EVO) wurde hergestellt, das identische Nährstoffkonzentrationen im Vergleich zum Basismedium aufwies, wobei das Testmedium jedoch anstelle von freiem Asn eine äquimolare Menge (5,4 mM) Gln-Asn-Dipeptid enthielt. Weiterhin wurde die freie Gln-Konzentration im Testmedium auf einen definierten Wert eingestellt, so dass die Gesamtkonzentration an Gln-Einheiten im Testmedium (d. h. freies Gln und Dipeptid-Gln) der Konzentration an freiem Gln im Basismedium entsprach. Alle anderen Nährstoffkonzentrationen im Testmedium waren die gleichen wie im Basismedium. Das Basismedium enthielt 1461,5 mg/l freies Gln und 612 mg/l freies Asn.

Sechs Zellkultivierungen wurden dann mit Medien, die unterschiedliche Mengen des Testmediums und des Basismediums in den folgenden Anteilen enthielten, durchgeführt:Tabelle 1:KultivierungBasismedium [%]Testmedium [%][Asn-Gln](freies Asn + Gln)(Asn-Gln-Dipeptid)mM#101005,4#220804,3#375251,4#485150,8#59550,3#610000,0

Alle Medien wurden auf pH 8,3 eingestellt. Der Salzgehalt des Kulturmediums wurde mit NaCl auf 285 mOsmol/kg eingestellt. Alle Kultivierungen wurden auf einem Rotationsschüttler unter identischen Kulturbedingungen (Temperatur, Feuchtigkeit, U/min, CO2, etc.) unter Verwendung von standardmäßigen Zellkulturmethoden durchgeführt. Es wurden drei Passagen einer Zellkultur durchgeführt, und die lebensfähige Zelldichte (VCD; 106 lebensfähige Zellen/ml) sowie die Zelllebensfähigkeit (%) wurden in zweifacher Ausfertigung unter Verwendung der Tryptophan-Blau-Bestimmung bestimmt.

Die lebensfähige Zelldichte [106 Zellen/ml] in der Kultivierung #1-6 ist in der 1 und Tabelle 2 dargestellt. Es konnte ein Zusammenhang zwischen maximalen lebensfähigen Zelldichte (dritte Passage) und der Konzentration des Dipeptids beobachtet werden. Die größte maximale lebensfähige Zelldichte wird in der Kultivierung #1 erhalten, d. h. in der Kultivierung, in der das gesamte Asn in der Form des Asn-haltigen Dipeptids bereitgestellt wird. Die niedrigste maximale lebensfähige Zelldichte wird in der Kultivierung #6 erhalten, d. h. in der Kultivierung, in der das gesamte Asn als freie Aminosäure bereitgestellt wird. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die erhöhte lebensfähige Zelldichte über einen verlängerten Zeitraum (Tag 13 bis Tag 18) aufrechterhalten wird. Daher wird ein positiver Effekt von Asn-haltigen Oligopeptiden auf die lebensfähige Zelldichte verdeutlicht. Tabelle 2:Zeit [h]#1#2#3#4#5#600,280,270,2650,270,2850,2650,890,590,510,4950,5650,4850,53,081,381,6151,82,2851,9851,933,711,642,132,4153,43,3252,84,080,3650,30,3150,3650,2650,34,700,560,540,650,6651,120,6655,691,331,5451,471,5451,5551,6156,883,163,5553,3653,363,84,1757,040,3350,3050,330,320,310,5057,800,6651,0450,771,121,171,18,781,261,5451,6151,862,012,3759,822,672,82,973,63,9-10,993,575,1155,256,316,0657,1112,024,917,2158,297,8058,21-12,756,4159,429,237,5457,1356,5213,898,2859,6458,9755,865,134,7714,7411,6959,9859,585,265,544,415,7910,07511,089,5354,0654,0753,8116,897,9959,1957,3953,1752,7753,50518,066,68,9055,9852,31,8252,725

Die Zelllebensfähigkeit [% lebensfähige Zellen in den Gesamtzellen] über die Kultivierungszeit ist in 2 und Tabelle 3 dargestellt. Kultivierungen, die mit Kulturmedien, die hohe Konzentrationen des Asn-haltigen Oligopeptids enthielten (Kultivierungen #1, #2, #3), durchgeführt wurden, zeigen eine relativ hohe Lebensfähigkeit der Zellen am Tag 18, während die Kultivierungen #4, #5 und #6 (mit einer niedrigeren Konzentration des Oligopeptids) eine signifikant verringerte Zelllebensfähigkeit am Ende des Experiments zeigen. Erfindungsgemäße Kulturmedien weisen somit einen positiven Effekt auf die Zelllebensfähigkeit [%] in Zellkultur auf. Tabelle 3:Zeit#1#2#3#4#5#6093,893,4592,8592,2593,5594,20,8996,396,295,2594,3593,394,83,0896,6596,2596,1595,795,9595,83,7195,8597,195,7596,5596,0596,254,0892,3595,0595,596,3595,3596,94,7094,6596,6597,897,0595,896,65,6996,5597,0596,196,659696,256,889797,4596,697,0596,5595,657,0498,697,196,4597,9598,8596,37,8096,3594,797,9596,295,5597,48,7898,259897,195,9596,5596,49,8287,395,195,895,8595,35-10,9996,997,0595,6596,696,8596,4512,0296,196,396,6596,896,35-12,7598,298,397,9595,996,0595,1513,8997,898,597,3590,859084,8514,7495,6597,1592,573,9567,8562,215,7987,888,681,550,346,0546,116,8972,178,4564,8539,0537,238,0518,0660,9572,2558,1526,4526,130,9

Der Produkttiter (Antikörperkonzentration am Ende der Kultivierung, t = 18 h, in relativen Einheiten) ist nachstehend in der 3 und Tabelle 4 dargestellt. Im Allgemeinen wird ein erhöhter Produkttiter in allen Kulturen, die das Asn-haltige Oligopeptid enthalten, beobachtet. In den Kultivierungen #2 und #3 (80% bzw. 25% des Asn ist in Form des Oligopeptids vorhanden) ist der Produkttiter mehr als 1,4-fach erhöht. Deutlich verbesserte Produkttiter werden in den Kultivierungen #1-# 4, d. h. bei molaren Konzentrationen des Oligopeptids von 0,8 mM bis 5,4 mM und darüber, erhalten. Tabelle 4:Kultivierungrel. Produkttiter [-]#11,19#21,41#31,42#41,11#51,01#61,00

Dulbecco\'s Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ist ein weit verbreitetes Basalmedium zur Unterstützung des Wachstums vieler verschiedener Säugerzellen. Zellen, die erfolgreich in DMEM kultiviert wurden, umfassen primäre Fibroblasten, Neuronen, Gliazellen, HUVECs und glatte Muskelzellen sowie Zelllinien, wie HeLa, 293, COS-7 und PC-12. Ein erfindungsgemäß ergänztes DMEM-Medium wird durch Hinzufügen von Gln-Asn zu handelsüblichem DMEM-Medium (Gibco(R) DMEM, High Glucose, SKU#41965-039, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA) hergestellt. Die Endkonzentration des Dipeptids in dem Medium beträgt 4,5 mM.

DMEM-Medium (Gibco(R) DMEM, High Glucose, SKU#41965-039, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA) wird mit einem Gln-Phe-Asn-Gln-Asn-Pentapeptid versetzt. Die Endkonzentration des Pentapeptids beträgt 4,5 mM.